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样品制备
1.蛋白提取：
裂解要快速，先变性后保存，在不影响后续实验的情况下尽量选择较强的裂解液。
裂解液选择：
蛋白提取要在低温条件下进行，防止蛋白自溶或降解，同时可以加入适当的蛋白酶抑制剂以减少蛋白酶的水解作用。
磷酸化蛋白提取还需加入蛋白磷酸酶抑制剂，以防止蛋白去磷酸化。
2.需对蛋白进行定量，确定合适的上样量，常用的为BCA法。
3.蛋白变性：
SDS-PAGE电泳
1.根据蛋白分子量的大小选择合适的胶浓度，蛋白分子量小应选择高浓度的胶，蛋白分子量大则选择低浓度的胶。
2.凝胶选择：
上部为5%浓缩胶，下部为不同浓度的分离胶，根据不同蛋白分子量选择分离胶浓度。
3.凝胶配置：
TEMED和APS促进凝胶反应，需现用现加，一般先加TEMED，后加APS。
常温下0.5h胶可凝固，若天气寒冷或需加快凝固，可将其置于37℃孵箱中加速凝固。
胶最好现配现用，如果需要短暂保存，要用湿润的保鲜膜包好并置于4℃冰箱中。
丙烯酰胺有神经毒性，配胶时需要戴手套操作。
4.缓冲液：
内槽电泳缓冲液要现配现用。
根据实验要求，选择变性/非变性的上样缓冲液。
根据蛋白分子量选择合适的预染Marker。
5.上样：
上样前可以适当离心去除气泡。
上样过程中，避免引入气泡，以防上样不均匀。
样品不要溢出样本孔。
吸头不要触及样本孔底部，否则条带会变形。
每个样本孔加入15-40μg蛋白，样品为纯化蛋白时，可能需要减少上样量。
6.跑胶：
浓缩胶电压一般采用100V左右，待溴酚蓝迁移出浓缩胶后再换为200V。
按照仪器制造商推荐的时间跑胶，不同机器的跑胶时间不同，具体取决于电压。
不要保存凝胶，应立刻进行转膜。
转膜
1.转膜方式选择
2.膜可能会产生自发荧光导致高背景，相较传统的PVDF膜，硝酸纤维素膜（NC膜）的背景低。
3.胶在负极，膜靠近正极，为防止短路，确保将滤纸和膜的大小剪裁得与凝胶一致，滤纸不要大过膜。
4.为避免手指接触膜影响实验结果，操作应使用镊子，并仅接触膜的边缘。
5.膜上可以剪一个小角用来标记正反面。
6.转膜缓冲液：
7.转膜缓冲液要提前冷却，且胶要在转膜缓冲液里平衡一下，防止胶变形，同时有助于去除影响转膜的杂质。
8.夹好膜和凝胶后，要确保凝胶、膜和滤纸之间无气泡。
9.转膜仪生产商一般会在自己的网站上提供详细的转膜流程。根据系统不同，具体转膜流程会有所不同。
10.湿转法转膜的电流一般在200-400mA之间，转膜时间为30-60min，也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据蛋白的分子量大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，分子量越小则需要的转膜时间越短。
11.可使用丽春红染色液初步检测转膜效率，它与下游WB检测兼容，无任何干扰。染色后可以用蒸馏水，PBS或者其他溶液洗去。可用于PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和醋酸纤维素膜上蛋白的检测，不适用于尼龙膜上的蛋白检测。
免疫印迹
1.封闭液的选择：
常见的封闭液有5%脱脂奶粉和BSA封闭液。
脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用。
脱脂奶粉不能用于碱性磷酸酶（AP）显色万法。
脱脂奶粉尽量不用于磷酸化抗体对蛋白磷酸化的检测。
2.封闭时间和封闭液剂量要足够，封闭不充分显色背景会过深。
3.洗膜时间要适当，洗膜时液体的体积大约需要15mL左右，需要晃动洗膜，一般用TBST洗涤5min×3次。洗膜次数可根据实际情况添加或减少，过度洗膜会使信号减弱。
4.一抗的稀释液可根据实际情况确定，可用5%脱脂奶粉稀释，也可直接用1×TBST稀释。
5.抗体的稀释倍数按照产品说明书和实验要求进行适当调整，抗体浓度不宜过高，适宜的一抗和二抗浓度可以提高信噪比。
6.如果使用的是荧光二抗，在加入其之后的步骤需要避光操作。
7.叠氮钠对HRP有抑制性，使用HRP为标记二抗时，缓冲液中不能使用叠氮钠作为防腐剂。
8.常见显影方法：
9.使用HRP-ECL发光法时，A、B发光液按比例稀释混合，现配现用。
10.不同蛋白最佳曝光时间不同，如果同一张膜上不同样品信号差异太大，可以尝试将膜剪开再分别进行曝光。
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