OD值低、标曲不达标、重复性差？你的生化检测问题，这篇都有解

生化检测的本质就是某物质化学变化的显色反应，其反应过程可以划分为四个区：延迟区、等速区、过渡区和平衡区，以时间为横坐标、吸光度为纵坐标作图，如下所示：

检测波长在小于400nm的紫外光区，需要用石英比色皿或96孔UV板检测；检测波长在大于400nm的可见光区，玻璃/石英比色皿、96孔板均可检测。若最终测定的反应液为有机试剂时（丙酮、乙酰乙酯、甲苯、氯仿等有机试剂），则需使用非聚苯乙烯材质的96孔板。

• 样本选择

新鲜样本和冷冻样本都可用于大多数指标的测定，但有一些生理活性物质容易降解，建议用新鲜样本测定，如辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ、谷胱甘肽、线粒体复合体等。

• 样本处理

动植物组织一般使用冰浴匀浆、液氮匀浆或者使用组织破碎仪进行匀浆。冰浴匀浆时注意防止摩擦升温；液氮研磨时注意防止反复冻融并做好防护。

肝素锂和EDTA抗凝血浆对某些酶法项目会有干扰，溶血、脂血、黄疸样本会干扰吸光度法读数，严重时要重采。血清需要及时分离避免细胞代谢改变分析物浓度。

细胞或细菌样品收集后，在细胞或细菌沉淀中加入一定量的提取液，混匀，将细胞或细菌悬浮于提取液中，在冰水浴条件下用超声破碎仪进行破碎。超声后的细胞溶液变得透明、清澈，菌液从枪头滴下不粘连。

土壤样本建议将鲜土风干并过筛后取样以保证重复性。风干后的土样在-20℃保存1个月测定大部分酶活几乎不会有损失，但硝态氮、铵态氮等成分在风干过程中会发生显著变化，需用新鲜样品分析。

• 样本稀释与浓缩

样本测定值若超出检测范围，可以将提取的上清液用提取液稀释后重新测定。一般从高到低，按照2倍，5倍，10倍，20倍的顺序，选择一个合适的稀释倍数。

样本测定值若低于检测范围，可以适当提高样本浓度。

• 样本保存

多数酶活或含量测定实验，采集后建议在-20℃以下低温保存。提取后的样本上清液建议当天使用完毕，反复冻融会影响酶活或含量。

样本保存过程中要尽可能避免样品中拟测定指标发生变化，缩短冷冻时间。有条件的情况下，样本取好后立即进行液氮速冻。如果不具备条件，也应该尽可能缩短样本进入超低温冰箱的时间。

冷冻样本建议在-70℃或者液氮中保存。一般样本在4℃能保存1周，-20℃保存1个月，-80℃保存3个月。制备好的匀浆液建议不要冻存，最好当天进行测定，如放置时间过长相关酶活会有所下降。

对于大体积样本，应该把样本分成小包装再液氮速冻或者放入超低温冰箱，避免反复冻融对样本的破坏。

• 仪器校准、测定

分光光度计：预热30min，用蒸馏水调零。

酶标仪：选择正确波长。

• 加样与反应

标准曲线制作（如需）：严格按说明书稀释标准品（避免跳孔）。

加样顺序：建议“空白-标准品-样本"减少误差。所有反应孔（或比色皿）的加样顺序应保持一致，以保证反应时间相同。吸取不同试剂时应更换吸头，配制不同组分时使用不同的储液器皿，防止交叉污染。

反应条件控制：加样后需充分混匀，确保显色反应。严格按说明书要求控制反应温度和反应时间，注意是否为避光反应。

分光光度法与微量法的反应体系、试剂浓度、仪器耗材均不同，不可混用或任意改变体系。

• 结果计算

生化试剂盒的结果计算通常基于特定的检测原理（如终点法、速率法等），并通过公式将测定的吸光度（OD值）或其他信号值转换为待测物的浓度或活性。反应结束后应立即测定，部分试剂盒要求在短时间内完成读数，时间过久会影响结果。

• 计算ΔOD值

终点法：ΔOD=样本OD-空白OD。

速率法：ΔOD/min=（反应末点OD-反应起点OD）/反应时间。

• 建立标准曲线（如需要）

以标准品浓度为横坐标，对应ΔOD为纵坐标，绘制标准曲线。

• 样本浓度计算

蛋白浓度校正：如需按蛋白浓度计算，需确认提取液是否可用于蛋白浓度测定；若提取液含蛋白沉淀剂或使蛋白变性，需另取样本测定蛋白浓度。

标准曲线：一般可直接使用试剂盒提供的标准曲线方程。稀释后的标准品应丢弃，不可保存使用。

批次一致性：若样本量过多需分批次实验，需确保试剂、仪器和操作步骤一致，避免批间误差。

    验证数据：