流式小课堂（三）丨流式对照知多少

在多色流式实验中，荧光溢漏是导致通道信号难区分、设门不准确的核心原因。随着检测指标增多，荧光素光谱重叠的概率增加，单一荧光的溢漏会被多色叠加放大，整体荧光溢漏情况持续变化——这种情况下，未染色的空白对照（未涉及荧光溢漏干扰）或全通道同型对照（无法覆盖多色交叉溢漏）均无法模拟全染背景，尤其对分群不明显、低表达量指标（需从大量阴性群体中识别阳性信号），必须依赖减一对照(FMO对照，Fluorescence Minus One)排除干扰。减一对照，又称荧光扣除对照或圈门对照，是多色流式分析中针对特定通道的阴性对照。其操作逻辑为：对目标通道不进行荧光染色，其余所有检测通道均按目标样本的染色方案完整染色，以此模拟“全染背景下，仅目标通道无特异性信号"的场景。

该对照主要应用于：研究不同细胞亚群的表型分子（如免疫细胞表面标志物）、细胞因子等指标的检测，尤其适用于多色（≥3色）实验或低表达指标分析。

1.排除全染背景干扰：通过“缺失一个通道荧光"，直观区分“目标通道的特异性信号"与“其他通道溢漏至该通道的非特异性信号"；

2.评估荧光溢漏程度：量化其他荧光染料向目标通道的溢漏比例，为补偿调节和设门提供精准依据；

3.确保设门准确性：在低表达、分群模糊的场景中，明确阴性群体的信号边界，避免因溢漏信号误将阴性细胞判定为阳性。

样本中死细胞的存在会极大地影响染色效果，因为死细胞具有更大的自发荧光，而且会增加非特异性的抗体结合，导致假阳性并增加背景信号，降低阳性信号的动态范围，这可能会使弱阳性样本和稀有细胞群体的鉴定变得困难。还可能会释放DNA，DNA非常黏稠，会导致细胞成团，容易堵塞管路。此外，死细胞无法刺激表达活化功能相关的标志物，从而导致一些比真实阳性率低的假阴性结果产生。使用基于FSC和SSC的门可以帮助清除部分碎片和死细胞，但无法全部移除，因此需要借助灵敏且特异性的染料对细胞进行活性分析。其原理是利用细胞死亡后的通透性改变来做特异性荧光标记，常见染料包括DNA染料类，分为两种，一种是膜不透过性染料（如PI、7-AAD），仅标记死细胞；另一类是膜透过性染料（如 Hoechst 33342），可标记活细胞核，常用于活细胞示踪或与 PI 联合使用进行死活双染。而荧光标记的Annexin V检测凋亡细胞，可结合外翻的磷脂酰丝氨酸。此外，还可以通过对细胞大小变化及理化性质的测定进行细胞活性检测。

其它实验对照，用于比较特定实验条件下样本之间的差别，主要分为以下几个类别：

1.阴性对照能够提供所有待测标志物的表达背景，用于比较细胞经过化学或生物学处理后的蛋白表达差异，例如细胞内染色实验涉及固定和破膜，这些步骤会影响抗原检测、自发荧光、荧光染料亮度和细胞形态。

2.阳性对照用于证实抗体在相关细胞中的阳性染色，以表明抗体在实验中起作用。

3.纵向对照/参考对照是长期研究的质量控制，可以确保实验过程中的染色一致性。