浅析荧光素标记的生物素操作步骤

　　(一)获得目的基因

　　1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点)，PCR循环获得所需基因片段。

　　2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

　　(二)构建重组表达载体

　　1、荧光素标记的生物素载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

　　2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

　　(三)获得含重组表达质粒的表达菌种

　　1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

　　2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

　　3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

　　(四)诱导表达

　　1、荧光素标记的生物素挑取含重组质粒的菌体单斑至2mlLB(含Amp50μg/ml)中37℃过夜培养。

　　2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中，37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0(*0.6，大约需3hr)。

　　3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养3hr。

　　4、分别取菌体1ml，离心12000g×30s收获沉淀，用100μl1%SDS重悬，混匀，70℃10min。

　　5、离心12000g×1min，取上清作为样品，可做SDS-PAGE等分析。